Frosch im Wassertropfen

 Analysemethoden und Laborarbeit

Extraktion & PCR

Damit Sie auch wissen, was wir da eigentlich so lange im Labor treiben, überbrücken wir die Wartezeit auf die Ergebnisse mit einem informativen Schwenk aus der Molekularbiologie. 😊

Wir verwenden zwei verschiedene Verfahren:

1.  Nachweis von Bd/Chytridpilz (Batrachochytrium dendrobatidis) mittels PCR (ähnlich dem Corona-Test; das ist nicht so aufwändig – siehe Grafik Punkt 1-2 und detaillierte Erklärung unten)
   
   
2.  Amphibien Metabarcoding / NGS – hier werden alle Proben auf alle Amphibienarten untersucht (siehe Grafik Punkt 1-9 und detaillierte Erklärung im nächsten Mail)

Was hier in der Grafik nicht ersichtlich ist, ist Erstellung des DNA-Extraktes – also die Gewinnung der kostbaren DNA aus Ihren Filtern und deren Aufreinigung, was die Grundlage aller Analysen ist. Darüber hinaus dauern die Punkte 1-5 je nach Probenumfang ebenfalls länger.

Wie entsteht ein Extrakt?

Im Labor eingetroffen werden die Proben mit einem speziellen Enzym versetzt, das die Zellwände löst und so die DNA freisetzt. Dazu werden die Proben wärmebehandelt („inkubiert“), um das Enzym arbeiten zu lassen. Die gewonnene Flüssigkeit bzw. die DNA darin wird mithilfe von Speziallösungen und einem Extraktionsroboter in mehreren Schritten gewaschen, sodass am Ende das reine „DNA-Extrakt“ entsteht. Übrig blieben je Probe nur 100 Mikroliter – das ist eigentlich nur ein Wassertropfen. 😊 Hier ist aber sämtliche Information aus dem Gewässer gespeichert! Das ist nun unser Schatz und die Grundlage für alle weiteren Analysen: PCR und das Next Generation Sequencing.

PCR Analyse von Bd (Batrachochytrium dendrobatidis)

Der Nachweis von Bd erfolgt mittels einer klassischen PCR (Polymerase Kettenreaktion – wie beim Corona-Test). In dem Verfahren wird untersucht, ob der Erreger in der Probe vorhanden ist, oder nicht – ja oder nein. Dazu haben wir einen speziellen Abschnitt im genetischen Code von Bd gewählt, der diesen Erreger eindeutig identifiziert. Mit Markierungspunkten, den sogenannten Primern, wird der zu kopierende Bereich klar eingegrenzt. Der bestimmte Abschnitt wird, sofern er denn in der Probe vorhanden ist, in der PCR dann millionenfach kopiert. Warum misst man das nicht einfach gleich in der Probe, ohne das aufwändige Kopieren, fragen Sie vielleicht? Erst das Vervielfältigen macht die DNA-Spuren messbar.

Für das Vervielfältigen benötigt man:

• DNA-Extrakt, das untersucht werden soll
• Positiv-Kontrolle – man muss ja wissen, ob die Reaktion prinzipiell funktioniert hat, auch wenn das Ergebnis negativ ist
• DNA-Bausteine – die Nukleotide: Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin
• Primer zum Markieren des Abschnitts
• DNA-Polymerase – dieses Enzym kopiert die Abschnitte
• Lösung, die alle Komponenten stabilisiert (Puffer und Salze)
• Thermocycler – hier werden ca. 90 Proben gleichzeitig mit wechselnden Temperaturen behandelt (Vervielfältigung/Amplifizierung)

 Das Vervielfältigen selbst passiert während zyklischer Heiz- und Kühlphasen, denen das Reaktionsgemisch ausgesetzt wird.

• Weil man sich das so nur schwer vorstellen kann, senden wir für Interessierte dieses anschauliche Video mit (ca. 9 Minuten)! 😊
  Unser „Täter“ ist hier Bd: Polymerase-Kettenreaktion (PCR) - Ein Verfahren zur Vervielfältigung von DNA

Hier noch ein interessanter Artikel zu Bd aus dem Standard: „Pandemie der Frösche - Pilz, der Amphibien massiv bedroht, ist weiter verbreitet als gedacht“  Julia Sica, 15. März 2023;

Nice to know: Die Autorin erwähnt, dass es in Österreich noch kein kontinuierliches Monitoring von Bd gibt - unser Ansatz hat das Zeug dazu, ein regelmäßiges, nationales Monitoring umzusetzen. 😊 Das hoffen wir (unter anderem), im Projekt FROSCH IM WASSERTROPFEN zu demonstrieren.

Das Metabarcoding ist etwas komplizierter. Hier sind ebenso die kostbaren DNA-Extrakte die Grundlage. Dann geht es weiter mit PCRs, wie vorab beschrieben – ABER: wir suchen nicht mehr eine einzige Art, sondern DNA von Amphibien.

Natürlich könnte man – wie nach dem Amphibienpilz auch nur gezielt nach DNA des Laubfroschs suchen, dann nach der Erdkröte, dem Teichmolch usw. Wir wollen aber alle Amphibienarten in einer Reaktion erfassen, anstatt jede einzelne Probe auf das Vorhandensein jeder einzelnen Amphibienart separat testen. Da nutzen wir lieber modernste Technik für uns (und Sie) und machen „einfach“ alles in einem Aufwasch. Das klingt zwar recht kompliziert (siehe unten 😊), spart im Endeffekt aber Zeit und Geld.

Bereit? Los geht’s! 😊
Tauchen Sie ein in die Welt des Metabarcoding

So wie es DNA-Abschnitte gibt, die ganz charakteristisch für eine Art sind, gibt es auch DNA-Abschnitte, die charakteristisch sind z.B. für die Gruppe der Amphibien. Die Amphibien-DNA-Abschnitte unterschieden sich deutlich von anderen Tieren, deren Spuren auch im Wasser gefunden werden können, wie z.B. Fische, Wasserinsekten, Wasservögel oder gar Menschen. Damit nur dieser bestimmte Abschnitt der DNA vervielfältigt wird, gibt es Sonden bzw. Primer, also Startermoleküle, welche den Bereich, der kopiert wird für die PCR „markieren“.

Durch diese „Amphibien-PCRs“ wird festgestellt, in welchen Proben überhaupt Amphibien-DNA nachweisbar ist. Danach durchlaufen die Proben einen Reinigungsschritt, um alle unspezifischen DNA-Reste „weg zu waschen“. Am Ende der PCR haben wir von allen vorhandenen DNA-Stücken von Amphibien in Ihrer Probe diesen speziellen Abschnitt zehntausendfach kopiert.

Es folgt eine zweite PCR, in der jede einzelne Probe unverwechselbar markiert wird – dazu werden an die DNA-Stränge in der jeweiligen Probe vorne und hinten Markierungscodes gebunden. Stellen wir uns einfach vor, jede Probe hat zwei farbige Mascherl dran – die Kombination dieser Mascherlfarben kommt dann in der finalen Mischung jeweils nur einmal vor. Das heißt, somit ist jeder DNA-Strang in der Probe ganz individuell erkennbar und ihr eindeutig zuordenbar. 

Dann werden diese markierten Stränge in einem zweiten Reinigungsschritt gewaschen, sodass keine „Mascherlreste“ mehr frei herumschwirren.

Nun wird die DNA-Konzentration in jeder Probe gemessen und im Anschluss manuell entsprechend verdünnt. Denn es soll von allen Proben gleich viel DNA verwendet werden. In unserem Fall 7 Nanogramm pro Mikroliter. Das sind 0,0000007 Gramm pro 0,001 Milliliter. So eine winzige Menge ist kaum vorstellbar, oder? In der Molekularbiologie braucht man ein sehr ruhiges Händchen und man muss extrem akkurat arbeiten. 😊

Danach können alle Proben zusammengemischt werden, denn die passenden Mascherln zur Wiedererkennung haben sie ja. Sämtliche Amphibien-DNA aus ALLEN Proben befindet sich schlussendlich in einem einzelnen 1,5 ml Röhrchen – das ist gerade mal so groß wie ein Daumen hoch.

Dann geht es auf zum Sequenzieren, also zum Lesen der DNA-Codes. Jede Amphibienart hat in dem Abschnitt einen ganz eigenen Code. Dies Abfolge kann man sich auch als Barcode, wie er etwa beim Einkaufen an der Kassa gescannt wird, vorstellen. Die Abfolge der Striche ist im Supermarkt genau einem Produkt zugeordnet.

Diese DNA-Barcodes werden mit jenen in einer öffentlich zugänglichen Datenbank verglichen, wo für jede Amphibienart Vergleichssequenzen hinterlegt sind. Wenn der Code in der Probe mit einer Art in der Datenbank übereinstimmt – dann habe ich einen Nachweis für diese Art in Ihrem Gewässer.

Gefundene Codes in einer Probe könnten - stark vereinfacht - wie folgt aussehen:

Amphibien-Code 1: …… TTA CGC TAT AAT CGC AAT GCG ATA TAC TTA ….               Laubfrosch-Code: CGC AAT GCG ATA

Amphibien-Code 2: …… TTA CGC TAT AAT CGC AAA GCG ATT TAC TTA ….               Erdkröte-Code:     CGC AAA GCG ATT

Es liegen hier zwei unterschiedliche Codes in einer Probe vor – gewisse Bereiche sind gleich (schwarz) andere unterscheiden sich (orange – Laubfrosch, rot – Erdkröte). So können hier zwei Arten unterschieden werden.

Aus diesem Datenbankabgleich erhalten wir für ALLE Proben ein Datenpaket mit unglaublichen Mengen an solchen DNA-Barcodes, die in einer bioinformatischen Analyse sortiert und wieder den Probennummern zugeordnet werden müssen, von denen sie stammen. Am Ende liegen für jede Probe die verschiedenen Artnachweise vor. Im Pilotprojekt konnten wir so bis zu fünf Amphibienarten in einer einzelnen Probe nachweisen.